เครื่องคำนวณการเชื่อมต่อสาย

หมวดหมู่: ชีววิทยา
- เมษายน 03, 2568
| |

เวกเตอร์ DNA

DNA แทรก

การตั้งค่าปฏิกิริยาเชื่อมต่อ

ปริมาณแทรกที่แนะนำ
8.3 ng
0.33 μL ของสต็อกแทรก
ปริมาณเวกเตอร์
50 ng
ใช้ 1 μL ของสต็อกเวกเตอร์
อัตราส่วนแทรก:เวกเตอร์
3:1 (โมลาร์)
เหมาะสำหรับการโคลนมาตรฐาน

การตั้งค่าปฏิกิริยาแบบครบถ้วน

ส่วนประกอบ ปริมาณ (μL) ปริมาณสุดท้าย
เวกเตอร์ DNA (50 ng/μL) 1.0 50 ng
DNA แทรก (25 ng/μL) 0.33 8.3 ng
10× T4 DNA Ligase Buffer 2.0 1×
T4 DNA Ligase 1.0 400 U
น้ำปราศจากนิวคลีส 15.67 ถึง 20 μL
ปริมาณรวม 20.0

เคล็ดลับการปรับแต่ง

ตามพารามิเตอร์ที่คุณป้อน นี่คือคำแนะนำบางประการ:

  • สำหรับปลายติด 5' ด้วยอัตราส่วนเวกเตอร์:แทรก 1:3 ให้บ่มที่ 16°C เป็นเวลา 4 ชั่วโมง
  • การรักษา CIP ของเวกเตอร์จะช่วยลดพื้นหลังการเชื่อมต่อเอง
  • หากประสิทธิภาพการเปลี่ยนแปลงต่ำ ให้ลองเพิ่มอัตราส่วนแทรก:เวกเตอร์เป็น 5:1
  • สำหรับการเชื่อมต่อปลายทื่อ ให้เพิ่มความเข้มข้นของ ligase และขยายเวลาในการเชื่อมต่อ
  • ทำให้ ligase ไม่มีฤทธิ์ที่ 65°C เป็นเวลา 10 นาที ก่อนการเปลี่ยนแปลงเพื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุด

เกี่ยวกับการเชื่อมต่อ DNA

  • การเชื่อมต่อ DNA เกี่ยวข้องกับการเชื่อมต่อชิ้นส่วน DNA ผ่านการสร้างพันธะฟอสโฟไดเอสเตอร
  • T4 DNA ligase ต้องการ ATP และ Mg²⁺ เพื่อทำงานอย่างถูกต้อง (จัดเตรียมในบัฟเฟอร์การเชื่อมต่อ)
  • การเชื่อมต่อปลายติดมีประสิทธิภาพมากกว่าการเชื่อมต่อปลายทื่อ
  • อัตราส่วนโมลาร์ของเวกเตอร์:แทรกมักอยู่ในช่วง 1:3 ถึง 1:5 สำหรับการโคลนมาตรฐาน
  • อัตราส่วนแทรก:เวกเตอร์ที่สูงกว่า (3:1 ถึง 10:1) แนะนำสำหรับการเชื่อมต่อปลายทื่อหรือแทรกที่ใหญ่กว่า
  • การทำให้เวกเตอร์ไม่มีฟอสเฟต (โดยใช้ CIP, SAP, ฯลฯ) ป้องกันการเชื่อมต่อเองของเวกเตอร์
  • ระบบ Quick ligase สามารถลดเวลาในการเชื่อมต่อให้เหลือ 5-15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง

สูตรสำหรับจำนวนที่ต้องการแทรก (ng):

\[ \text{Insert ng} = \left( \frac{\text{Vector ng} \times \text{Insert size in kb}}{\text{Vector size in kb}} \right) \times \left( \frac{\text{Insert moles}}{\text{Vector moles}} \right) \]

เครื่องคิดเลขการเชื่อมต่อคืออะไร?

เครื่องคิดเลขการเชื่อมต่อเป็นเครื่องมือที่ช่วยให้นักวิจัยกำหนดจำนวนที่เหมาะสมของ DNA เวกเตอร์และแทรกที่จำเป็นสำหรับปฏิกิริยาการเชื่อมต่อที่ประสบความสำเร็จ การเชื่อมต่อ DNA เป็นขั้นตอนที่สำคัญในกระบวนการโคลนโมเลกุล ซึ่ง DNA แทรกจะถูกเชื่อมต่อกับเวกเตอร์พลาสมิดโดยใช้อินซัยมที่เรียกว่า DNA ligase

มันทำงานอย่างไร?

เครื่องคิดเลขนี้ช่วยให้ผู้ใช้ป้อนรายละเอียดเกี่ยวกับเวกเตอร์และแทรก รวมถึงความยาวและความเข้มข้น ตามอัตราส่วนโมลาร์ที่เลือก มันจะคำนวณจำนวน DNA แทรกที่จำเป็นเพื่อให้ได้ปฏิกิริยาการเชื่อมต่อที่เหมาะสม

คุณสมบัติหลัก

  • คำนวณอัตราส่วนโมลาร์ระหว่างเวกเตอร์และแทรกสำหรับสถานการณ์การโคลนที่แตกต่างกัน
  • รองรับอัตราส่วนโมลาร์ทั้งแบบมาตรฐานและแบบกำหนดเอง
  • ให้คำแนะนำเกี่ยวกับเงื่อนไขการเชื่อมต่อขึ้นอยู่กับการโคลนแบบติดหรือแบบทื่อ
  • รวมเคล็ดลับการปรับแต่งเพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพการเชื่อมต่อ

วิธีการใช้เครื่องคิดเลข

  1. ป้อนความยาวของเวกเตอร์ (bp) และความเข้มข้น (ng/μL)
  2. ป้อนความยาวของแทรก (bp) และความเข้มข้น (ng/μL)
  3. เลือกอัตราส่วนโมลาร์ระหว่างเวกเตอร์และแทรกที่ต้องการ (เช่น 1:3, 1:5)
  4. ระบุปริมาตรทั้งหมดของปฏิกิริยา (เช่น 20 μL)
  5. สำหรับการตั้งค่าขั้นสูง ให้เลือกอุณหภูมิการเชื่อมต่อ ระยะเวลา ประเภท ligase และตัวเลือกการรักษาเวกเตอร์
  6. คลิก “คำนวณ” เพื่อสร้างจำนวนแทรกที่แนะนำและการตั้งค่าปฏิกิริยา

คำถามที่พบบ่อย

อัตราส่วนโมลาร์ระหว่างเวกเตอร์และแทรกที่เหมาะสมคืออะไร?

สำหรับการเชื่อมต่อแบบติด แนะนำให้ใช้อัตราส่วนเวกเตอร์ต่อแทรกที่ 1:3 หรือ 1:5 สำหรับการเชื่อมต่อแบบทื่อ อาจใช้อัตราส่วนที่สูงกว่า (เช่น 1:5 ถึง 1:10) เพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพ

ทำไมจึงแนะนำให้ทำการ dephosphorylation ของเวกเตอร์?

การ dephosphorylation (โดยใช้ CIP, SAP หรือ Antarctic Phosphatase) จะป้องกันการเชื่อมต่อเองของเวกเตอร์ ลดการเกิดโคลนพื้นหลังที่ไม่ต้องการ

ควรใช้เงื่อนไขการเชื่อมต่ออย่างไร?

  • 16°C เป็นเวลา 4 ชั่วโมง – เงื่อนไขมาตรฐานสำหรับ T4 DNA ligase
  • อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาที – เหมาะสำหรับ Quick Ligase
  • ข้ามคืนที่ 16°C – แนะนำสำหรับการเชื่อมต่อที่ท้าทายหรือการโคลนแบบทื่อ

ฉันจะปรับปรุงประสิทธิภาพการเชื่อมต่อได้อย่างไร?

  • ตรวจสอบให้อัตราส่วนโมลาร์ระหว่างเวกเตอร์และแทรกถูกต้อง
  • ใช้ DNA ligase และบัฟเฟอร์ที่สดใหม่
  • ปรับแต่งเงื่อนไขการเชื่อมต่อ (อุณหภูมิและระยะเวลา)
  • ยืนยันการมีอยู่ของแทรกผ่านการอิเล็กโทรโฟเรซิสก่อนการเชื่อมต่อ

ทำไมต้องใช้เครื่องคิดเลขนี้?

เครื่องคิดเลขการเชื่อมต่อนี้ช่วยให้การตั้งค่าปฏิกิริยาการเชื่อมต่อ DNA ง่ายขึ้น ช่วยให้นักวิจัยกำหนดจำนวนที่เหมาะสมของเวกเตอร์และแทรกสำหรับการโคลนที่มีประสิทธิภาพ โดยการทำให้การคำนวณเป็นอัตโนมัติและเสนอเคล็ดลับการปรับแต่ง ช่วยประหยัดเวลาและเพิ่มอัตราความสำเร็จของการทดลองการเชื่อมต่อ